小麥的加工品質(zhì)與小麥中各種蛋白質(zhì)的含量和組成密切相關(guān)。高分子量谷蛋白(HMW-GS)、低分子量谷蛋白(LMW-GS)和醇溶蛋白交聯(lián)形成三維面筋網(wǎng)絡(luò)骨架，直接決定小麥的加工品質(zhì)。闡明面筋蛋白的交聯(lián)機(jī)理對(duì)于改善小麥的加工品質(zhì)具有重要意義。2001年，Tilley等人[30]提出了谷蛋白酪氨酸交聯(lián)理論，挑戰(zhàn)了谷蛋白二硫鍵交聯(lián)的經(jīng)典假說(shuō)。結(jié)果表明，酪氨酸交聯(lián)的形成是由過(guò)氧化物酶或具有過(guò)氧化物酶性質(zhì)的酶催化的。本研究從小麥種子中分離純化了一種小麥過(guò)氧化物酶，并對(duì)其理化性質(zhì)和光譜特性進(jìn)行了研究。利用生物質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF)對(duì)WsPOD肽的指紋圖譜進(jìn)行了初步研究。酪氨酸催化實(shí)驗(yàn)表明WsPOD具有酪氨酸交聯(lián)活性；WsPOD的微觀混合實(shí)驗(yàn)表明，WsPOD能改善面團(tuán)的流變特性。本研究旨在闡明面筋蛋白酪氨酸交聯(lián)的催化機(jī)理，支持和完善面筋交聯(lián)的新理論，從而建立小麥品質(zhì)改良的新策略，為食品工業(yè)中廣泛使用的化學(xué)添加劑尋找安全的替代品。

1.wspod的分離純化。關(guān)于過(guò)氧化物酶的分離純化已有不少報(bào)道，但小麥中過(guò)氧化物酶的分離純化報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)建立了一種高效、簡(jiǎn)便的小麥種子過(guò)氧化物酶WsPOD分離方法。通過(guò)乙酸沉淀、硫酸銨分級(jí)沉淀、FPLC源30S離子交換柱層析和FPLC super dex G-75凝膠過(guò)濾柱層析，從小麥種子中分離出電泳純的WsPOD。SDS-PAGE結(jié)果顯示單一條帶；SDS-PAGE顯示表觀分子量約為36KD。

2.wspod的理化性質(zhì)。以愈創(chuàng)木酚為底物，獲得了WsPOD催化反應(yīng)的pH值、過(guò)氧化氫濃度、溫度和熱穩(wěn)定性。測(cè)定了光譜特性和其他物理化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，WsPOD催化反應(yīng)的最適pH值約為5.0，最適反應(yīng)溫度為40，最適過(guò)氧化氫濃度為14 mmol/L，紫外-可見光譜掃描顯示該酶為一種含血紅素輔助基團(tuán)的酸性蛋白，在399nm處有典型的Soret吸收帶。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明WsPOD具有良好的耐熱性。

3.WsPOD肽指紋圖譜。使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對(duì)分離的WsPOD進(jìn)行肽指紋，發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)結(jié)果與現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中WsPOD的肽指紋相匹配。獲得的數(shù)據(jù)表明WsPOD是一種胚乳特異表達(dá)的過(guò)氧化物酶，保守性表明該酶有兩個(gè)保守區(qū)域，即過(guò)氧化物酶催化活性位點(diǎn)和血紅素輔助近端結(jié)合位點(diǎn)。從WsPOD的肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)中獲得的序列信息為WsPOD的cDNA克隆奠定了良好的基礎(chǔ)。

4.WSPOD酪氨酸交聯(lián)活性的測(cè)定。WsPOD催化單體酪氨酸反應(yīng)的產(chǎn)物用UV-1100紫外-可見分光光度計(jì)掃描，并用HPLC-ESI/MS，結(jié)果表明WsPOD能催化單體酪氨酸形成二聚體酪氨酸，具有酪氨酸交聯(lián)活性。

5.wspod微量摻雜實(shí)驗(yàn)。以洛陽(yáng)8716為參考基粉，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14614-93，采用50 g制粉進(jìn)行微配粉試驗(yàn)。結(jié)果表明，WsPOD能延長(zhǎng)面團(tuán)形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間，改善面粉品質(zhì)指標(biāo)，使面團(tuán)更有粘性、彈性和耐揉性。

6.雙酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)合成。根據(jù)Michael Tilley等人的方法，通過(guò)化學(xué)合成得到二元酪氨酸混合物，用HPLC-C 18顯示相柱分離純化出純的二元酪氨酸，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了內(nèi)標(biāo)。